Introducción al proyecto final

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Semana 12 (14 de Agosto)

Después de una larga ausencia, a causa de las vacaciones de invierno, nos sentamos junto a nuestra investigadora, Patricia Setton-Avruj a hacer la última revisión de la introducción para así dejarla lista, además de también reforzar ciertos conceptos teóricos.

Semana 11 (24 de Julio)

Hoy se sacrificó a uno de los animales con 7 días de sobrevida, para el análisis de su mielina. A diferencia de otras extracciones del nervio ciático, esta vez le extrajimos a la rata de la pata que tenía el nervio ciático injuriado (ipsilateral) y el nervio ciático sano (contralateral). Le extrajimos a una sola rata, para analizar una que tenga sobrevida de 7 días, y en futuros experimentos utilizaremos la segunda rata, para analizar una mayor sobrevida. En este caso le sacamos ex nervio contralateral que pesaba: 20 mg.
Pero la parte ipsilateral la dividimos en dos partes: La parte del nervio que está conectada a la medula espinal hacia la parte injuriada, se llama zona proximal, y en este caso pesa 8,10 mg. La otra parte mas alejada de la medula se llama distal. Esta última pesa 11,60 mg. Este día preparamos las respectivas soluciones de sacarosa (ya nombradas en otro día que vinimos aquí.) centrifugamos y obtuvimos el pellet. No llegamos a hacer las correspondientes mediciones espectrofotométricas (que se realizará en otro día). La idea de este experimento es comparar la composición proteica de la mielina normal del nervio contralateral, y de las correspondientes a la zona proximal y distal

Semana 10 (17 de Julio)

Nosotros ya teníamos el gel preparado de la semana pasada. Hoy nos encargamos de largar la corrida electroforética propiamente dicha:
Nosotros sabíamos que nuestra cantidad de proteínas por unidad de volumen era:

Entonces sabiendo que se desea sembrar siempre la misma cantidad de proteínas, para que en la corrida, la diferencias esten dadas por las diferente composición de las muestras o las diferentes situaciones experimentales y no por la cantidad sembrada. Entonces de todos estos se siembra solo 40 ug de proteínas. El volumen que se deberá sembrar de cada uno para llegar a los 40 ug será:

Entonces el volumen total de siembra para cada caso será:

Luego a cada uno se le debe agregar un volumen de buffer Laemmli que equivalga a la cuarta parte del volumen de cada muestra; en este caso:

Entonces el volumen total de siembra para cada caso será:

Una vez hecho esto se lleva a ebullición para desnaturalizar por completo a las proteínas, y de esta forma asegurarse que las diferentes bandas que vayan a dar en la electroforesis se deba al peso molecular de la proteína y no a su forma globular u otra estructura terciaria que haga que el resultado en verdad difiera. Las proteínas deben tener únicamente su estructura primaria, es decir, su cadena extendida de aminoácidos, la cadena polipeptídica.

Habiendo realizado los pasos previos, introdujimos el gel en la cuba electroforética para la posterior realización de la corrida.

El gel esta armado de tal manera que nos quedan 4 calles con la siembra de nuestras 4 muestras y la primera calle con el marker (mezcla de proteínas con peso molecular conocido, del cual se siembran solo 5 ul):

El voltaje inicial con el cual se debe comenzar la electroforesis es de 50 V. Luego de que la corrida haya pasado el Stacking, el voltaje se cambia a 100V
Lamentablemente no pudimos sacar una foto del gel listo, sin embargo un dibujo de lo observado sería:

Este mismo día operamos 2 animales realizando una compresión nerviosa en cada uno para poder dejarlos 7 días de sobrevida y luego analizar los cambios ocurridos; para esto debimos hacer el mismo procedimiento que con la extracción del nervio pero con el animal vivo, anestesiado y cuidando al esterilidad del proceso para que la injuria sea exitosa, ya que de haber muerto el animal, habría sido en vano.

Semana 9 (10 de Julio)

Hoy preparamos por primera vez un gel de poliacrilamida, para hacer la corrida electroforética de nuestras proteínas de la mielina extraída. Preparamos un gel al 12,5 % de poliacrilamida, de acuerdo al siguiente protocolo:

Luego de esperar alrededor de media hora para que gelifique, se agrega por sobre éste el stacking donde se colocara el peine durante el proceso de gelificacion y que contiene los pocillos en los que se cargarán las muestras para que entren al gel de corrida de manera simultánea.

Stacking:

Una vez preparado el gel lo dejamos en la heladera hasta la semana siguiente para que se conserve de manera adecuada hasta el momento de realizar la corrida.

Semana 8 (3 de Julio)

Continuamos con la cuantificación de las proteínas en la muestra de mielina que extrajimos el 19/6.

Primero de todo medimos el volumen de mielina aislada que obtuvimos:

(Las celdas tachadas indican valores de transmitancia porcentual que es muy imprecisa, y no están cerca de los otros dos valores, por lo que no pueden ser promediables. Por este motivo el promedio se tomó con los dos valores mas cercanos entre si en esos casos)

Aplicando la ecuación de la curva de calibración se obtiene los microgramos de proteínas en 5 ul tomados:

Entonces podemos informar el resultado de proteínas de mielina por unidad de tejido como sigue:

Semana 7 (26 de Junio)

Este día Daniel estuvo enfermo por lo que debió ausentarse, en cuanto a mi, Eitan, junto a Patricia, realizamos una corrección general del blog y luego de esto observe la realización de una inmunocitoquímica por las becarias del laboratorio.