Semana 6 (19 de Junio)

Lanzamos nuestra primera extracción y aislamiento de mielina.

Para comenzar desde cero comenzamos por preparar soluciones de distinta concentración de sacarosa para realizar los gradientes de concentración.

Mr(sacarosa) = 342.3 g/mol

342.3g/mol x2mol = 684.6g

Preparamos 100 ml una solución 2M y a partir de esta hicimos diluciones para obtener soluciones 0.85M y 0.32M

684.6 g --------------------1000 ml

68.46 g=x------------------100 ml

Para preparar cada una de las diluciones a partir de la solución 2M, hicimos:

Sabiendo que en una dilución el nº de moles no cambia utilizamos:

M1 x V1 = M2 x V2

Para preparar 30 ml de una solución 0.85 M

V1 = (30 ml x 0,85 M)/2 M

V1 = 12.75 ml

Y para preparar 15 ml de una solución 0.32 M hicimos:

V1 = (15 ml x 0,32 M)/2 M

V1 = 2.40 ml

Armamos el siguiente gradiente de concentración:

Los distintos tonos de gris indican las distintas fases con las soluciones de distintas concentraciones. Se ve mas claramente la diferencia entre 2 M y 0,85 M. Entre 0, 85 M y 0,32 m recién se ve cuando se agrega el homogenato de nervio.Luego de finalizados los gradientes, extrajimos el nervio ciático del animal muerto, y luego de esto pesamos cada nervio:

D1 --> 40,60 mg

D2 --> 36,50 mg

E1 --> 25,90 mg

E2--> 51,20 mg

Las letras D y E corresponden a nuestros nombres ya que cada uno tuvo su animal al cual extraerle el nervio.

Luego de pesados cada uno de los nervios, los disgregamos con tijeras para luego homogeneizarlos en 2ml de una solución de sacarosa 0.32M

Pasamos los homogenatos a los tubos con los gradientes y los colocamos en adaptadores del rotor swinging SW28 para luego centrifugarlos a 25000rpm a 4º C por 45 minutos.

Es importante recordar que, al ser llevados a 25000 rpm los adaptadores deben pesar exactamente lo mismo para que, por la velocidad, no salgan disparadas o se desbalanceen causando algún desperfecto en la centrifuga.

Pasados los 45 minutos, retiramos los tubos de los adaptadores viendo como resultado que en la interfase entre el gradiente de 0.85 M y 0.32 M queda flotando la mielina en forma de anillo el cual extrajimos con una micro pipeta y llevamos a volumen en otro tubo con agua fría y se lo deja reposar 20 minutos. Este proceso se llama shock de mielina.

Finalizado el tiempo de reposo se lo centrífuga 20 minutos a 10000 rpm y el pellet que se obtiene es la mielina purificada.