Semana 4 (5 de Junio)

Esta semana Eitan debió ausentarse por lo que yo, Daniel, luego de una breve explicación teórica de Patricia, realicé una cuantificación de proteínas.

Determinación de proteínas por el método de Lowry
El método de Lowry se basa en una reacción calorimétrica para la determinación de proteínas. Al añadirle el reactivo (folin) a una muestra de las mismas se forma un complejo coloreado del cual es posible medir la transmitancia mediante un espectrofotómetro, que, según la ley de Lambert-Beer, la intensidad del color de la disolución resultante es proporcional a la concentración de proteínas. Para determinar la concentración de proteínas de la muestra incógnita se construye una curva de calibración a partir de una solución de albúmina de suero bovino (2 mg/ml). La concentración que tiene la muestra incógnita se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El blanco, que sólo contiene agua destilada y los reactivos, sirve para el ajuste del espectrofotómetro a cero de absorbancia (100% T).
Procedimiento:
· Si el volumen de las alícuotas de muestras o Standard es alto se debe evaporar a sequedad en baño de 60ºC

·Agregar 0,2 ml de agente hidrolizante (NaOH 0,5 N para citosol y microsomas, NaOH 0,5 N con SDS al 2% para mielina), vortexear e incubar a temperatura ambiente (15 minutos para citosol y microsomas, 30 minutos para mielina)

· Agregar 1 ml de solución de tartrato de cobre preparada en el momento:

Na2 CO3 al 2%-----------------------------49.0 ml 20, 0 ml 30,0 ml 40,0 ml

Cu SO4 x 5 H2O al 1% -----------------1,0 ml 0,4 ml 0,6 ml 0,8 ml

Vortexear y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente.

· Agregar 0,1 ml de reactivo de folin (diluir en el momento 1/3), agitando tubo por tubo y dejar 30 minutos a temperatura ambiente.

· Leer en el espectrofotómetro a 750 nm.

Nota: la lectura en el espectrofotómetro debe ser hecha durante los primeros 60 minutos después de realizada la reacción ya que pasado este tiempo, pierde la estabilidad.

Este método consta de dos etapas:

1) Se le agrega tartrato de cobre II y carbonato de calcio (proporciona el medio alcalino). Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin‑Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Antes de la lectura el aparato se ajusta al 100% de transmitancia con el blanco; de esa forma sólo se mide el color producido por las proteínas, puesto que se resta el color debido a los reactivos.

Para obtener los siguientes resultados, debimos realizar una curva de calibración, a partir de una muestra patrón de albúmina, y con la ecuación de dicha curva obtuvimos la cantidad de proteínas en cada muestra incógnita.

Como la concentración de proteínas en el hígado medida nos dio fuera del rango de la curva, es decir que estaba muy concentrado, deberemos diluir la muestra para que los valores de la muestra estén dentro de dicha curva de calibración, haciendo así que la experiencia tenga una mayor confiabilidad.

Este mismo día ayudé en la extracción de ARN mensajero de las células de Schwann:

Extracción de ARN mensajero de las Células de Schwann
Esta técnica difiere en que se tiene que tener el cuidado de no hablar, debiéndose usar barbijos, para evitar que actúen las ARNasas, enzimas que podrían llegar a digerir el ARN, perjudicando el trabajo.

En el momento de matar al animal se lo rocía con alcohol, porque no se quiere ningún inconveniente con la extracción de ARN, como bacterias u otras contaminaciones que degraden el ARN.

Se procede a la extracción de las células de Schwann del mismo modo que en la extracción para el cultivo de las mismas explicadas en la entrada anterior.

Luego se continúa hasta obtener células de Schwann aisladas

· Se centrifuga 5’a 2000 rpm.

· se descarta el sobrenadante

· se resuspende el pellet con igual volumen de DMEM + 10% de FCS,

· resuspender con vortex con agitación suave, con golpecitos, NO usar pipeta de vidrio.

· Disgregación mecánica: se realizan 10 pasajes por aguja 21G y 10 por aguja de 24G

Hasta aquí describimos el aislamiento de las células de Schwann, a partir de las cuáles aislaremos el ARN.

En el proceso mismo de extracción del ARN, nosotros no estuvimos presentes.

Sabemos de todos modos que luego de su extracción se usa la enzima virosica, transcriptasa reversa, para obtener la cadena de ADN copy que es el gen sin los intrones, desde este ADN se obtendría por polimerización la cadena de ARN mensajero para la síntesis de la cadena polipeptídica.

Se siembran en placas de petri pequeña o mediana (dependiendo del número de células que tengamos).